Genomul uman

Tratatul distinșilor cercetători științifici și doctori în genetică Georgeta Cardoș și Alexander Rodewald este mai mult decât o pledoarie pentru adevăr, este adevărul însuși. în ultimii 20 – 25 de ani, tehnicile de excepție din laboratoare, analizele sofisticate, comparațiile edificatoare cu alte genomuri umane, toate metodele noi, inimaginabile acum 50 sau 100 de ani, fac posibile acum descifrări genetice din mumii umane cu o vechime de peste 35.000 de ani, cum sunt resturile umane din Peștera Cioclovina. Mai mult decât atât, în ultimii zece ani, paleogenetica moleculară este domeniul cu înregistrări de succese remarcabile care confirmă multe dintre ideile care, înainte, erau simple ipoteze.

În tratat sunt prezentate cercetările și concluziile de paleogenetica moleculară făcute la populații vechi din Epoca Bronzului și din Epoca Fierului și care au trăit pe teritoriul actual al României. De asemenea, sunt scoase în evidență relațiile surprinzătoare din punct de vedere genetic ale altor neamuri europene, în comparație cu neamul românesc.

Meritul fundamental al autorilor cărții este acela de a fi demonstrat științific structura genetică, originea, evoluția și răspândirea geografică a omului contemporan. De asemenea, dânșii au scos în evidență structura socială a populațiilor vechi și a celor actuale, combinațiile genetice ale diferitelor popoare de-a lungul timpului și importanța pe care aceste descoperiri o are în medicina legală, în analiza și diagnosticarea bolilor genetice, precum și în modul prin care pot fi tratate. Ca urmare, descoperirile genetice au semnificații de importanță vitală pentru viața oamenilor și, de asemenea, ele contribuie fundamental la cunoașterea și evaluarea originii unui neam de pe pământ.

Cartea Genomul uman este un veritabil și demn de prețuit document, pentru că are știința ca structură și ca fundament. Ideile care se desprind din paginile cărții coincid cu ceea ce societatea pe care am onoarea să o conduc, „Reînvierea Daciei" ("Dacia Revival"), afirmă răspicat de aproape două decenii: noi suntem urmașii daco-geților și nu ai romanilor, noi nu suntem urmașii Rome!

Adresez cele mai calde felicitări autorilor pentru uriașa și migăloasa pregătire științifică și tehnică, pentru munca asiduă de laborator, pentru observațiile pe care le-au prezentat într-o formă care să poată fi înțeleasă de un public mai larg, pentru sistematizarea materialelor, pentru fotografiile inspirate, pentru tabelele și schemele revelatoare dar, mai ales, pentru superba lor pasiune ca oameni de știință pentru care adevărul nu are nicio legătură cu politica și nici cu opinia altora.

Recomand călduros această carte tuturor românilor care vor să știe de unde se trag ca neam și care vor să afle adevărul pe calea științei genetice. Vor putea constata pe baze științifice că, într-adevăr, Noi nu suntem urmașii Romei!

Prefață de dl. dr. Napoleon Săvescu ... 5
Prefață din partea autorilor ... 7

   1. GENOMUL UMAN ... 9

1.1. ADN - "molecula vieții" ... 9
1.2. Genomul nuclear ... 10
1.3. Polimorfisme ADN ... 11
   1.3.1. Polimorfisme ADN RFLP ... 12
   1.3.2. Polimorfisme ADN VNTR ... 13
   1.3.3. Polimorfisme ADN SNP ... 13
   1.3.4. Polimorfisme ADN STR ... 13
       1.3.4.1. Rata de mutație a microsatelitilor ... 15
       1.3.4.2. Polimorfisme STR în studiile de ADN vechi ... 16
       1.3.4.3. Markerul ADN HuVWA3IA ... 17
   1.3.5. Polimorfisme STR pe cromozomul Y ... 17
       1.3.5.1. Rata de mutație a polimorfismelor STR de pe cromozomul Y ... 18
       1.3.5.2. Polimorfismul STR DYS392 ... 18
       1.3.5.3. Polimorfismul STR DYS393 ... 19
1.4. Identificarea sexului genetic cu ajutorul genei amelogeninei ... 19
1.5. Genomul mitocondrial ... 20
   1.5.1. Structura si organizarea genomului mitochondrial ... 20
   1.5.2. Genomul mitocondrial uman ... 22
       1.5.2.1. Generalități ... 22
       1.5.2.2. Moștenirea genomului mitocondrial și heteroplasmia ... 23
       1.5.2.3. Absența recombinării moleculelor de ADNmt la om ... 25
       1.5.2.4. Rata mutației in ADNmt ... 26
       1.5.2.5. Inserții nucleare de secvențe de ADNmt ... 28
       1.5.2.6. Homoplazia ... 29
   1.5.3. Nomenclatura haplogrupurilor mitocondriale ... 30
   1.5.4. Șiruri nucleotidice hipervariabile în regiunea de control din ADNmt ... 31
   1.5.5. Variația ADNmt în populația umană ... 32
       1.5.5.1. Variația ADNmt în Europa ... 32
       1.5.5.2. Variația ADNmt în Africa ... 36
       1.5.5.3. Variația ADNmt în Asia ... 37
       1.5.5.4. Variația ADNmt în Australia si Oceania ... 37
       1.5.5.5. Variația ADNmt în Lumea Nouă ... 38
1.6. Originea, evoluția si răspândirea omului modern ... 38
1.7. Originea fondului genetic European actual ... 41

   2. PALEOGENETICA-DOMENIUL CERCETÃRII MOLECULELOR DE ADN VECHI ... 44

2.1. Introducere ... 44
2.2. Degradarea moleculelor de ADN vechi ... 45
2.3. Extractia de ADN vechi ... 46
2.4. Autentificarea rezultatelor ... 46
2.5. Contaminarea probelor biologice vechi cu ADN modern ... 47
   a) Contaminarea la nivelul sitului arheologic ... 47
   b) Contaminarea în cadrul laboratorului ... 48

   3. SCOPURILE STUDIULUI NOSTRU DE PALEOGENETICA ... 49

   4. MATERIALE SI METODE ... 50

4.1. Introducere ... 50
4.2. Materiale ... 50
   4.2.1. Probele umane vechi ... 50
       4.2.1.1. Probele umane vechi datate din Epoca Bronzului ... 51
       4.2.1.2. Probele osoase umane vechi din Epoca Fierului ... 54
   4.2.2. Probele biologice de la indivizi din populația romanească actuală ... 57
4.3. METODE ... 58
   4.3.1. Precauții necesare pentru prevenirea contaminării probelor cu ADN exogen ... 58
       4.3.1.2. Spatii de lucru special destinate cercetării de ADN vechi ... 58
       4.3.1.3. Prevenirea contaminării externe ... 59
       4.3.1.4. Tratarea tuburilor PCR ... 59
       4.3.1.5. Autentificarea rezultatelor ... 60
   4.3.2. Pretratamentul probelor osoase ... 62
   4.3.3. Extracția de ADN ... 62
       4.3.3.1. Extracția de ADN vechi ... 62
       4.3.3.2. Extracția de ADN din sânge ... 63
   4.3.4. Reacția PCR ... 63
       4.3.4.1. Principiul reacției PCR ... 63
       4.3.4.2. Amplificarea ADN prin PCR în studiul de față ... 65
           4.3.4.2.1. Markeri de ADN mitocondrial amplificați prin PCR ... 66
           a) Regiunea de ADNmt HVR I ... 67
           b) Regiunea de ADNmt HVR II ... 68
           c) Regiunea de Control V ... 69
           4.3.4.2.2. Markeri de ADN nuclear ... 69
           a) Gena amelogeninei ... 69
           b)Markerul ADNnvon Willebrand(VWA31A) ... 70
       4.3.4.3. Testul PCR pentru inhibitori ... 71
       4.3.4.4. Purificarea extractelor de ADN vechi ... 71
   4.3.5. Electroforeza ADN ... 71
       4.3.5.1. Principiul electroforezei ... 71
       4.3.5.2. Electroforeza în gel de agaroză ... 71
       4.3.5.3. Electroforeza în gel de poliacrilamidă ... 72
       a) Prepararea plăcilor de sticlă ... 73
       b) Prepararea gelului de poliacrilamidă ... 74
       c) Prepararea probelor de ADN ... 74
       d) Migrarea în gel de poliacrilamidă ... 74
       e) Colorarea gelurilor de PAA cu argint ... 75
   4.3.6. Secvențierea ADN ... 75
       4.3.6.1. Principiul secventierii ADN ... 75
       4.3.6.2. Purificarea produsilor de PCR pentru secventiere ADN ... 76
       4.3.6.3. Secvențierea ADN în acest studiu ... 76
   4.3.7. Alinierea secvențelor de ADN ... 77
   4.3.8. Analiza statistică ... 77
       4.3.8.1. Baza de date ADN ... 77
       4.3.8.2. Metode de analiză la nivel intra-populațional ... 77
           4.3.8.2.1. Atribuirea haplogrupurilor ... 77
           4.3.8.2.2. Diversitatea (genică) haplotipică ... 78
           4.3.8.2.3. Numărul de șiruri polimorfice (S) ... 78
           4.3.8.2.4. Indicatori moleculari ... 79
               4.3.8.2.4.1. Numărul mediu de diferențe dintre perechile de haplotipuri ... 79
               4.3.8.2.4.2. Diversitatea nucleotidică ... 79
           4.3.8.2.5. Rețele filogenetice ale haplotipurilor de ADNmt ... 79
           4.3.8.2.6. Testul Tajima de neutralitate selectivă ... 79
           4.3.8.2.7. Echilibrul Hardy-Weinberg ... 80
           4.3.8.2.8. Testul Chi pătrat ... 80
       4.3.8.3. Metode de analiză la nivel inter-populațional ... 80
           4.3.8.3.1. Testul exact de diferențiere a populațiilor ... 80
           4.3.8.3.2. Analiza variantei moleculare AMOVA ... 80
           4.3.8.3.3. Distanțele genetice dintre populații ... 81
           a) Analiza distanței FST ... 81
           b) Distanța genetică Nei ... 81
           c) Distanța genetică Cavalli-Sforza ... 82
           4.3.8.3.4. Arbori filogenetici ... 82
           4.3.8.3.5. Analiza componentului principal PCA ... 82

   5. REZULTATE SI DISCUȚII ... 83

5.1. ANALIZA LA NIVEL INTRA-POPULATIONAL ... 83

   5.1.1. Analiza genetică a eșantionului de indivizi din populația umană veche ... 83
       5.1.1.1. Considerații generale ... 83
       5.1.1.2. Autenticitatea moleculelor de ADN vechi ... 86
       5.1.1.3. Alegerea protocolului de tratare a tuburilor PCR ... 88
       5.1.1.4. Analiza ADN mitocondrial vechi ... 89
       a) Analiza Regiunii de Control V din ADNmt ... 89
       b) Analiza regiunilor mitocondriale HVR I si HVR II ... 90
       5.1.1.5. Analiza de ADN nuclear ... 105
       a) Analiza markerului microsatelit VWA3IA ... 105
       b) Analiza genei amelogeninei ... 108
       c) Markeri pe cromozomul Y ... 110
   5.1.2. Analiza ADNmt în populația actuală din România ... 110
5.2. ANALIZA LA NIVEL INTER-POPULATIONAL ... 113
   5.2.1. Analiza de ADN mitocondrial ... 113
       5.2.1.1. Testul exact de diferențiere a populațiilor ... 113
       5.2.1.2. Analiza diversității genetice ... 114
       5.2.1.3. Testul Tajima de neutralitate selectivă ... 118
       5.2.1.4. Analiza variantei moleculare AMOVA ... 119
       5.2.1.5. Distanțe genetice și arbori filogenetici construiți pe baza datelor de ADNmt ... 119
   5.2.2. Analiza ADN nuclear ... 121
       5.2.2.1. Testele Chi pătrat ... 121
       5.2.2.2. Echilibrul Hardy-Weinberg ... 122
       5.2.2.3. Distante genetice si arbori filogenetici realizați pe baza datelor de ADNn ... 122
       5.2.2.4. Analiza Componentului Principal ... 124
5.3. DISCUȚII ... 126
   5.3.1. Discuții asupra rezultatelor de ADNmt ... 126
   5.3.2. Discuții asupra rezultatelor de ADNn ... 129
       5.3.2.1. Markerul microsatelit VWA31 A ... 129
       5.3.2.2. Discuții asupra datelor de amelogenină ... 130
       5.3.2.3. Discuții asupra markerilor de pe cromozomul Y ... 131

5.4. CONCLUZII FINALE ... 134

Appendix A ... 135
Appendix B ... 142
Bibliografie ... 147
Abstract ... 155